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在讲解精准定量的计算之前，我们需要了解一下分光光度法的原理，由于Oligo中的碱基之间存在共轭双键，共轭双键对光具有强吸收的特点，因此当测量吸收光谱时，在波长260 nm或接近260 nm处都有一个吸光度（Absorbance, A₂₆₀），如下图所示：

但是，我们在引物管上通常见到的是OD值，什么是OD₂₆₀？

OD₂₆₀是指在260 nm波长处的光密度（Optical Density, OD），OD260测量单位定义为使用1cm的光程（pathlength）、测量260 nm波长处、1 ml寡核苷酸溶液产生读数为1.0时所需要的寡核苷酸浓度。OD₂₆₀值与A₂₆₀值相关，计算公式为：

OD₂₆₀ = A₂₆₀ x 体积(ml) /光程(cm)

由于OD260测量时体积为1 ml，光程为1 cm，所以OD₂₆₀值= A₂₆₀值。

1. 常见定量误区

DNA定量和RNA定量一般称为核酸定量，通常测量样品中DNA或RNA的平均浓度，然后再进行下游实验。通常，在260 nm处的吸光度即可用于测量溶液中存在的核酸的浓度。近似的转换系数为:

a. 双链DNA（ds DNA）约为50 μg/OD₂₆₀；

b. 单链DNA（ss DNA）约为33 μg/OD₂₆₀；

c. 单链RNA约为40 μg/OD₂₆₀

当OD=1时，依据：

摩尔数(μmol)=质量/分子量=（转换系数x OD）/分子量（MW）

代入浓度计算公式：

摩尔浓度(μmol/L,μM) =（摩尔数/体积）x 1000

*分子量（MW）的计算方式见文章最后部分

值得注意的是，转换系数计算公式只适用于长的、碱基随机排列的序列，对于长度较短的序列，重复序列，以及带有特殊修饰基团的Oligo序列，每个碱基的组成、排列顺序和修饰都会影响序列计算，导致定量准确率较低。

2. 什么是Oligo精准定量？

       对于Oligo的定量，为了保证得到准确的定量结果，通常不能直接使用仪器测定的ng/μl数值，尤其对于带有修饰的Oligo探针, 直接使用仪器测定的ng/μl数值会使定量结果出现很大的偏差。这时就需要引入对于寡核苷酸的定量计算至关重要的数值：消光系数（Extinction coefficient，ε）。

        消光系数和最大吸收波长都会随着共轭双键数量的增加而增加，每个碱基的吸光度不同，碱基的组成和排列顺序都会影响吸光度，因此在定量过程中引入了消光系数进行计算。消光系数依赖于精确的核苷酸组成和排列顺序，对于每个寡核苷酸来说消光系数是唯一的，因此，通过计算每个寡核苷酸的消光系数精确值，可以获得最高的定量准确度。

3. 如何计算Oligo的消光系数（ε）？

太阳集团tyc官方入口使用邻近法（Nearest neighbor method）计算每个合成的寡核苷酸的消光系数，然后用来计算每个寡核苷酸的产量。计算公式为：

其中：ε₂₆₀：寡核苷酸序列在 260 nm 处的消光系数，单位为（L/mol·cm）；

Σ₁^N-1ε_{Nearest Neighbor}：相邻碱基对的消光系数之和；   

Σ₂^N-1ε_{Individual Bases}：单个碱基的消光系数之和；

Σ₁^Nε_{Modifications}：修饰的消光系数之和。

参考邻近值：

单个碱基值：

*即使邻近法相对准确，但是其结果也可能与真值存在偏差。

4. 如何通过消光系数（ε）计算Oligo的浓度？

根据朗伯比尔定律（Beer-Lambert Law）：

A₂₆₀ = ε₂₆₀ × C × p  （1）

推导出：

C = A₂₆₀ /（ε₂₆₀ × p）  （2）

其中：c：Oligo浓度（mol/L）；A：吸光度；ε：消光系数（L/mol·cm）； p：光程（cm）

当光程p=1 cm，进行单位换算后，

可得太阳集团tyc官方入口浓度计算公式：

C = A₂₆₀ × (1/ε₂₆₀) × 10⁶= A₂₆₀ × nmol/OD

其中：c：Oligo浓度（μmol/L，μM）；A：吸光度；nmol：物质的量单位；OD：光密度

5. 如何计算Oligo的分子量（MW）？

引物合成单上出现的另一个重要数据是分子量，MW用来将OD260单位转化为质量单位，

寡核苷酸的总分子量即所有碱基的原子量之和，再根据不同类型进行调整：

  a. 无5’单磷酸盐的DNA序列：ssDNA-61.96 Da，dsDNA-123.38 Da；

  b. 含5’单磷酸盐的DNA序列：ssDNA+17.04 Da，dsDNA+34.08 Da；

  c. 含5’三磷酸盐的RNA序列：RNA+ 159.0 Da；

单位为道尔顿（Dalton，Da），1 Da ≈ 1 g/mol

举个例子来看一下依据经验值的模糊浓度计算和太阳集团tyc官方入口精确浓度计算之间的差别：

如ss DNA寡核苷酸序列5’-ATGGCTAC-3’

常规计算：

分子量MW=313.21x2+304.20x2+329.21x2+289.18x2-61.96=2409.64 Da≈2409.64 g/mol

摩尔浓度(μmol/L,μM)=（转换系数/分子量（MW））×1000

摩尔浓度(μmol/L,μM)=（33/2409.64）× 1000≈13.69 μM

太阳集团tyc官方入口计算：

消光系数计算ε₂₆₀=77,600 L/mol·cm

C (μmol/L，μM)= A₂₆₀×(1/ε₂₆₀)×10⁶=A₂₆₀×nmol/OD=A₂₆₀ ×10⁶/77,600≈12.89 μM

*1 μM=1 μmol/L=1 pmol/μl

太阳集团tyc官方入口Oligo合成

相较于仪器测定的ng/μl数值，太阳集团tyc官方入口的浓度计算方式更为准确，尤其是对于长度较短的或者带有特殊修饰基团的Oligo序列，更加贴近于真值。

太阳集团tyc官方入口依托专业的技术人员、自动分装设备和成熟的合成纯化工艺，尽可能减少操作过程中的损失，确保Oligo精准和系统性定量

*更多合成需求请联系当地销售人员

参考文献：

[1]https://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/oligo-quantification-getting-it-right

[2]https://www.omnicalculator.com/biology/dna-concentration#spectrophotometric-analysis-of-nucleic-acids-dna-and-rna-quantification

[3]https://www.trilinkbiotech.com/an-introduction-to-extinction-coefficients-and-molecular-weights-of-oligos

[4]Cavaluzzi MJ, Borer PN. (2004) Revised UV extinction coefficients for nucleoside–5‘–mono¬phosphates and unpaired DNA and RNA. Nucleic Acids Res, 32(1) e13.

[5]Cantor CR, Warshaw MM, Shipiro H. (1970) Oligonucleotide interactions. III. Circular dichroism studies of the conformation of deoxyoligonucleolides. Biopolymers, 9(9):1059−1077.